基因突变检测系统（Bio-rad Dcode）

仪器编号：20110478

仪器名称：基因突变检测系统

仪器型号：Bio-Rad/Dcode

生产厂家：Bio-Rad

安置地点：教工路2号实验楼519

技术指标：

系统功能灵活，适合多种突变检测方法

在癌症研究发展及多种单基因或多基因疾病的研究过程中，

探索未知突变起着非常重要的作用。DNA 多态性是物种的

生态与进化研究非常有用的工具。应用范围包括物种鉴定、

种群结构分析及遗传多样性研究等。

DCode 系统由带温度控制模块（包括微处理器控制加热）

的电泳设备、一个缓冲液再循环泵、一个搅拌器及铺制特殊应用凝胶的附件组成。冷却槽及一个外部实验室冷却器可把运行温度控制在室温下。一块凝胶能在2 个小时内运行64 个样品，并提供5-70℃ 范围内的精确温度控制。它可与下列的电泳技术配合使用来检测单碱基变化：

• 单链构象多态性（SSCP）

• 变性梯度凝胶电泳（DGGE）

• 时间温度梯度电泳（TTGE）

• 均一变性凝胶电泳（CDGE）

为了获得最高的通量和效率，许多实验室采用多种技术。在快节奏研究环境中，不同方法间的快速切换和转换到新技术的能力是非常关键的。

用途及测试范围：

DCode 系统能迎合所有主要突变检测技术的需要。其灵活的功能与优点包括：

• 温度控制选择

• 模块式设计，可满足用户现在与将来的需要

• 专用的组合配件，简化启动过程

• 针对特定技术的试剂和对照物，适合DGGE、CDGE、SSCP 和TTGE 等技术

使用方法：

（一）变性梯度凝胶电泳DGGE 操作步骤：
1、将海绵垫固定在制胶架上，把类似‘三明治’结构的制胶板系统垂直放在海绵上方，用分布在制胶架两侧
的偏心轮固定好制胶板系统，注意一定是短玻璃的一面正对着自己。
2、共有三根聚乙烯细管，其中两根较长的为 15.5cm，短的那根长 9cm。将短的那根与Y 形管相连，两根
长的则与小套管相连，并连在 30ml 的注射器上。
3、在两个注射器上分别标记‘高浓度’与‘低浓度’，并安装上相关的配件，调整梯度传送系统的刻度到适当
的位置。
4、反时针方向旋转凸轮到起始位置。为设置理想的传送体积，旋松体积调整旋纽。将体积设置显示装置固
定在注射器上并调整到目标体积设置，旋紧体积调整旋纽。例如16*16cm gels(1mm thick)：设体积调整装
置到 14.5。
5、配制两种变性浓度的丙烯酰胺溶液到两个离心管中。
6、每管加入 18 μl TEMED，80 μl 10%APS，迅速盖上并旋紧帽后上下颠倒数次混匀。用连有聚乙烯管标
有‘高浓度’的注射器吸取所有高浓度的胶，对于低浓度的胶操作同上。
7、通过推动注射器推动杆小心赶走气泡并轻柔地晃动注射器，推动溶液到聚丙烯管的末端。注意不要将胶
液推出管外，因为这样会造成溶液的损失，导致最后凝胶体积不够。
8、分别将高浓度、低浓度注射器放在梯度传送系统的正确一侧固定好，注意这里一定要把位置放正确! 再
将注射器的聚丙烯管同 Y 形管相连。
9、轻柔并稳定地旋转凸轮来传送溶液，在这个步骤中最关键的是要保持恒定匀速且缓慢地推动凸轮，以使
溶液恒速的被灌入到三明治式的凝胶板中。
10、小心插入梳子，让凝胶聚合大约一个小时。并把电泳控制装置打开，预热电泳缓冲液到60℃。
11、迅速清洗用完的设备。
12、聚合完毕后拔走梳子，将胶放入到电泳槽内，清洗点样孔，盖上温度控制装置使温度上升到 60℃。
13、用注射针点样（预先准备好的活性污泥 16S rDNA V3 区 PCR 扩增产物，变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯
化）。
14、电泳（200V，5h）。
15、电泳完毕后，先拨开一块玻璃板，然后将胶放入盘中。用去离子水冲洗，使胶和玻璃板脱离。
16、倒掉去离子水，加入 250 ml 固定液（10% 乙醇, 0.5% 冰醋酸）中，放置 15min。
17、倒掉固定液，用去离子水冲洗两次，倒掉后加入 250 ml 银染液（0.2% AgNO3,用之前加入 200μl 甲
醛）中，放置在摇床上摇荡，染色 15min。
18、倒掉银染液，用去离子水冲洗两次，倒掉后加入 250 ml 显色液（1.5% NaOH, 0.5% 甲醛）显色。
19、待条带出现后拍照。
（二）温度梯度凝胶电泳TGGE 操作步骤：
1、去离子水仔细洗涤制胶所用玻璃板，用纸巾擦干。再用酒精棉球擦一遍，用纸巾擦干。将支持膜夹在两
块玻璃板之间，用夹子夹住，放置在桌上。
2、配胶 (每块胶配 5ml) 丙烯酰胺/双丙烯酰胺储存溶液（40%，37.5: 1）：丙烯酰胺: 38.96g，双丙烯酰胺:
1.03g 溶于 100 ml 去离子水。
3、将玻璃板倾斜放置，用 1ml 的移液器将上面配置的胶慢慢灌入两玻璃板之间。将玻璃板水平放置半小
时以上，使胶凝固。
4、待胶凝固后，先用手拨去没有点样孔的玻璃板。用去离子水将支持膜背面冲洗干净，用纸擦干。再揭开
支持膜。
5、用 1ml 移液器在 TGGE 的温度面板（thermoblock）上加 800 μl 0.1% Triton。
6、用手抓住支持膜的两边，先将膜中部放于加热面板上，再慢慢将膜铺展开，在膜和加热面板间尽量不要
形成气泡。温度梯度方向和电泳方向一致。
7、将预先准备好的样品加入上样孔中，每孔最多加 3 μl 样品。
8、在胶的两端盖上 Waterman 滤纸（buffer wick），滤纸的另一端浸入电泳缓冲液中。
9、盖上盖子，预电泳（200V，7min）。
10、预电泳快结束时（6min 50sec），暂停反应。打开盖子，揭开滤纸。在凝胶中间慢慢盖上一层塑料膜（cover
film）。再将滤纸盖在胶上，然后用一块玻璃板（coverplate with sealings）压在滤纸上。
11、盖上盖子，继续电泳（200V，3h）。
12、电泳结束后，终止程序。将支持膜取出，先用去离子水冲洗一次。
13、将膜转移至固定液（10% 乙醇, 0.5% 冰醋酸）中，放置 5min。
14、将膜转移至去离子水中冲洗一次，再转移至银染液（0.2% AgNO3,用之前加入 40μl 甲醛）中，放置在
摇床上摇荡，染色 10min。
15、将膜在去离子水中冲洗 2 次，转移至显色液（1.5% NaOH, 0.5% 甲醛）中。
16、待条带出现后，将膜用去离子水冲洗 3 次，拍照。
注意事项：
1、配置试剂时一定要用去离子水，制胶洗膜时用的各个容器也要用去离子水洗涤干净，以防止氯离子污染。
2、制胶是实验的关键。在往玻璃板中灌胶时，要匀速地转动滑轮，将凝胶液匀速地灌入玻璃板。
3、灌完胶后，立刻清洗注射器，以防丙烯酰胺凝固，堵塞管子。
4、DGGE 的电泳缓冲液要超过“RUN”刻度线，不要超过“Maximam”刻度线。
5、点样时，要用小型注射器，伸入点样孔底部点样。
6、银染的整个过程中，一定要戴手套。以避免手接触胶而带来的污染。
7、每次用完仪器后要及时清理，清洗玻璃板培养皿等玻璃仪器。
其它：
1、配置试剂时一定要用去离子水，制胶洗膜时用的各个容器也要用去离子水洗涤干净，以防止氯离子污染。
2、保护层（protection foil）用来保护温度面板（gradient block），要防止试剂浸入，每次用完后要把残余的
试剂吸干。一旦破损，应停止使用，更换后再继续使用。
3、TGGE mini system T1T2 之间的温度差不能超过 45℃。
4、支持膜和温度面板间一定要加 0.1% Triton，从而确保能形成稳定的温度梯度。
5、在铺支持膜于温度面板上时，要尽量避免气泡，否则会导致温度梯度不稳定。
6、如果要中途暂停或中断电泳,一定要在打开盖子前先关掉电源。
7、电泳过程中,不要触摸电极线和电泳缓冲液(高压!)。
8、从胶放到 gradient block 上到点样完毕要尽量快速，最好不要超过五分钟。
9、银染的整个过程中，一定要戴手套。以避免手接触胶而带来的污染。
10、每次用完仪器后要及时清理，清洗玻璃板培养皿等玻璃仪器。